Molekulārajā bioloģijā laba buferšķīduma izvēle un sagatavošanās dažādiem DNS izolācijas posmiem var būt atšķirība starp pāreju uz olbaltumvielu ekspresiju vai citas maksimālā preparāta komplekta atvēršanu, lai sāktu. Neskatoties uz to būtisko nozīmi, bufera receptes bieži vien ir tikai receptes, kas rakstītas bez dažādu komponentu izskaidrojuma vai pamatojuma. Viens šāds buferis ir glikozes-tris-EDTA vai GTE buferis.
$config[code] not foundKas ir GTE?
GTE lieto, lai atkārtoti suspendētu baktēriju šūnu granulas pirms šūnu lizēšanas un atdalīšanas no plazmas. Lizocīms, kas mīkstina šūnu membrānas, bieži tiek pievienots kopā ar GTE buferšķīdumu. Lai panāktu labu DNS iznākumu, šī soļa laikā tiek panākta viendabīga visu šūnu suspensija, lai vēlāk pievienotās līzes šķīdums varētu nokļūt visās šūnās. GTE ir izstrādāts tā, lai nodrošinātu DNS stabilu vidi.
Glikoze Osmolaritātei
Lai uzturētu osmolaritāti, GTE buferšķīdumam pievieno 50 mM (milimolāru) glikozes cukuru, ja šķīdinātāju koncentrācija ārpus šūnām ir tuvu šūnu iekšējai koncentrācijai. Tas novērš priekšlaicīgu šūnu līzi, kas var izraisīt zemāku DNS iznākumu agregācijas un noārdīšanās dēļ. Pārējās bufera sastāvdaļas arī veicina šķīduma osmolaritāti, bet glikoze, kas nav elektrolīts, ir laba izvēle, jo tas netraucē šķīduma bufera īpašības.
PH stabilitāte Tris
Tris ir īss trīs (hidroksimetil) aminometāna nosaukums, kas ir ļoti bieži sastopams pH buferis. GTE bufera gadījumā skābes sāls (Tris-HCl) tiek pievienots buferim ar koncentrāciju 25 mM. Tas saglabā šķīduma pH gandrīz fizioloģiskā 8,0, ideāls pH, lai novērstu plazmīda DNS skābes hidrolīzi un citu šūnu komponentu nevēlamās blakusreakcijas.
EDTA novērš DNS degradāciju
EDTA, vai etilēndiamīntetraetiķskābe, uztver vai "savieno" metāla jonus no šķīduma, neļaujot viņiem piedalīties nevēlamās blakusparādībās. GTE buferšķīdumā EDTA pievieno pie 10 mM. Tās galvenais mērķis ir buferšķīdums, lai noapaļotu brīvu cinku, magniju un kalciju, tādējādi novēršot DNS degradāciju, izmantojot noteiktus ceļus, kas prasa šos metālus.
Daži svarīgi padomi
Saglabājiet GTE buferšķīdumu aukstu un padara to nelielā daudzumā, lai novērstu neparedzētu baktēriju augšanu tajā. Cukurs un kontrolētais pH dod lielu augšanas vidi. Vienmēr izmantojiet attīrītu ūdeni. Krāna ūdenim no caurulēm var būt pārmērīgs metāla jonu daudzums, kas var pārņemt EDTA spēju uztvert. Ja jums ir aizdomas par traucējošu RNS klātbūtni jūsu paraugā, pievienojiet RNase A pie 100 mikrogramiem mililitrā jūsu GTE buferim, lai novērstu šo problēmu.
